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蛋白质提取过程中常用蛋白酶和磷酸酶抑制先容
  • 发布日期:2016-04-01     信息来源:      浏览次数:3269
    • 在与蛋白相关的检测中,zui关键的一步便是蛋白质的提取。在提取的过程中,大家要经常加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中,磷酸酶抑制剂也是*的。
       
             本文详细总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF、Leupeptin亮肽素、Aprotinin抑肽酶、Pepstatin胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycerophosphate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。

      一、蛋白酶抑制剂
      PMSF:
      特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。 
      溶解性:溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇,25℃时稳定至少9个月。
      分子量:174.2
      使用:贮存浓度200mM,工作浓度1mM
       
      Leupeptin 亮肽素
      特性:抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
      溶解性:高度溶于水(1mg/ml)。4℃一周稳定,分成小份,冷冻在-20℃至少6个月。
      分子量:C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6  C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6
      使用:贮存浓度1mg/ml,工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
       
      Aprotinin抑肽酶
      特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。
      溶解性:易溶于水(10mg/ml)或缓冲液(例如0.1M tris,pH8.0)。pH约7~8的溶液在4℃可保存1周,分装保存在-20℃可至少保存6个月。避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
      分子量:6,512
      使用:贮存浓度1mg/ml,工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。
       
      Pepstatin胃蛋白酶抑制剂
      特性:抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶
      溶解性:溶于甲醇约1mg/ml; 可溶于乙醇,第二天溶解可达到1 mg/ml;在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4℃稳定一周,分装储存于-20℃时可保存1个月。
      分子量:685.9
      使用:贮存浓度1mg/ml,使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。
       
      EDTA-Na2
      特性:金属蛋白酶抑制剂
      溶解性:溶于水至0.5M,在pH8-9的条件下,4℃稳定至少6个月
      分子量:372.24
      使用:工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM),不需现用现配,在溶液pH值调至8~9时再加入。
       
      二、磷酸酶抑制剂
      NaF氟化钠 
      溶解性:溶于水
      分子量:41.99
      使用:贮存液5M,工作浓度10~20mM。
       
      Na3VO4 原矾酸钠 
      分子量:183.91
      溶解性:溶于水,大家购买过来的是原矾酸钠。原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用。原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM原矾酸钠激活储存液配制
      (1). 取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)。
      (2). 煮至无色
      (3). 室温冷却
      (4). 重调pH至10
      (5). 重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色,并且pH稳定于10,分装100ul/管,每10ml裂解液加一管。
      使用:贮存液100mM, 工作浓度1mM,-20度保存。
       
      Beta-glycerophosphate 甘油磷酸钠
      溶解性:溶于水
      分子量:306.11
      使用:贮存液100mM,工作浓度25mM。
       
      Na2P2O4 焦磷酸钠
      溶解性:溶于水
      分子量:265.9

      使用:贮存液100mM,工作浓度1-2 mM。

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